Роль эпигенетических механизмов регуляции группы опухоль-ассоциированных генов в патогенезе немелкоклеточного рака легкого
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
В последние годы количество онкологических заболеванийнеуклонно растёт. В структуре онкологических заболеваний рак лёгкого занимает первые позиции по заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей, как в мире, так и в России (Sung H. et al., 2021). В России от рака легкого умирают около 40 тыс. человек в год, причем в ряде регионов смертность у мужчин выше, чем в большинстве стран мира, достигая более 60 случаев на 100 тыс. человек.
На немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) приходится 80-90% всех мировых случаев выявления злокачественных опухолей легкого. Причем этот вид рака легкого отличается частым метастазированием, а именно в 40% случаев на момент постановки диагноза. Пятилетняя выживаемость при диагностике на первой-второй стадии составляет 57-67%, на третьей – 5-25% и на четвертой – менее 1% (Каприна А.Д. и др., 2021). Поэтому, исследование процессов возникновения и прогресии НМРЛ, а также выявление новых молекулярных маркеров являю
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Канцерогенез. Основные понятия
1.2. Система эпигенетической регуляции
1.2.1. Метилирование ДНК
1.2.2. МикроРНК и рак
1.3. Опухоль-ассоциированные гены, участвующие в путях запрограммированной клеточной гибели
1.4. Рак легкого
1.5. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Общая характеристика образцов НМРЛ
2.2. Выделение ДНК и РНК из биологического материала
2.2.1. Выделение геномной ДНК из ткани
2.2.2 Выделение суммарной (тотальной) РНК
2.3. Оценка экспрессии белок-кодирующих генов методом SYBR Green ПЦР в реальном времени
2.3.1. Реакция обратной транскрипции
2.3.2. SYBR Green ПЦР в реальном времени
2.4. Оценка экспрессии генов микроРНК методом TaqMan ПЦР-РВ
2.4.1. Реакция обратной транскрипции
2.4.2. ПЦР с детекцией в реальном времени
2.5. Бисульфитная конверсия ДНК
2.6. Метил-специфичная ПЦР-РВ (МС-ПЦР-РВ)
2.7. Программное обеспечение
2.8. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Ассоциация аберрантного метилирования белоккодирующих генов и генов миРНК с развитием и прогрессией НМРЛ
3.2. Связь аномальной экспрессии белоккодирующих генов и миРНК с развитием НМРЛ и его гистологических подтипов
3.3. Роль аберрантного метилирования в нарушение экспрессии мРНК генов и 9-ти генов миРНК при НМРЛ
3.4. Поиск взаимодействий миРНК – ген-мишень при НМРЛ
3.5. Метилирование генов миРНК – новый маркер для диагностики и прогноза НМРЛ
3.6. Влияние аномального метилирования и экспрессии генов DAPK1, APAF1, BIM, BAX, BCL2 и миРНК на патогенез немелкоклеточного рака легкого
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аушев В.Н. МикроРНК: малые молекулы с большим значением // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. – 2015. – Т.8 № 1. – С. 1-12.
2. Брага Э.А. Системы маркеров на основе метилирования генов микроРНК в диагностике рака молочной железы на I-II стадиях / Е.А. Филиппова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины // 2019. – Т. 168. № 8. – С. 238-242.
3. Греков И.С., Кондратюк Р.Б. Некроптоз: Новая Форма Программируемой Гибели Клеток (Обзор Литературы) / Медико-Социальные Проблемы Семьи. – 2020. – T.25. №3. – С. 83-89.
4. Грин И.Р. Редактирование эпигенетических модификаций ДНК / Д.В. Петрова, Д.О. Жарков // Гены & Клетки. – 2016. – Т. 11. №2. – С. 53-60
5. Губенко М.С. Изменение уровня метилирования группы генов микроРНК как фактор развития и прогрессии немелкоклеточного рака лёгкого / В.И. Логинов и др.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2022. – Т. 174. № 8. – С. 222-227.
6. Губенко М.С. Метилирование ДНК в регуляции экспрессии генов апоптоза при немелкоклеточном раке легкого / В. И. Логинов и др. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2022. – Т. 66. - № 4. – C. 5-12.
7. Губенко М.С., Роль микроРНК в канцерогенезе немелкоклеточного рака легкого / Логинов В.И., и др.// Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2022. Т. 30, № 1. С. 123–131.
8. Гудкова А.Я. Множественные функции опухолевого супрессора p53 // О.И. Антимонова, М.М Шавловский // Медицинский академический журнал. – 2022. T. 22. № 1. – С. 73-88.
9. Деев Р.В. Современные представления о клеточной гибели / Билялов А.И., Жампеисов Т.М. // Гены & Клетки. – 2018 Т. XIII. №1.
10. Запорожченко И.А. Основы биологии микроРНК: строение, биогенез и регуляторные функции / Е.Ю. Рыкова, П.П. Лактионов // Биоорганическая химия. – 2020. Т. 46. №1. – С. 3-17.
11. Каприн А.Д. Злокачественные новообразования в России в 2020 году (заболеваемость и смертность) / В.В. Старинский, А.О. Шахзадова // МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. − 2021. – C. 252.
12. Клаг У.С. Основы генетики / М.Р. Каммингс, А.Ш. Спенсер, М.А. Палладино \\ 8-е изд., доп. М.: Техносфера. - 2021. С. 944.
13. Кобяков Д.С. Взаимосвязь маркеров апоптоза (р53, BCL-2, BAX) с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого / А.Ф. Лазарев и др.// Сибирский Онкологический Журнал. – 2014. – Т. 5. – С. 10-16.
14. Комина А.В. МикроРНК и малые интерферирующие РНК как инструменты направленной регуляции клеточных процессов для терапии онкологических заболеваний. С.Н. Лаврентьев, Т.Г. Рукша // Бюллетень сибирской медицины. – 2020. – Т. 19, №1. – С. 160-171.
15. Логинов В.И. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников / А.В. Малюкова и др. // Молекулярная биология. – 2004. – T. 38. №4. – С. 654-667.
16. Логинов В.И. Аберрантное метилирование 21 гена микроРНК при раке молочной железы: наборы генов, связанных с показателями прогрессии, и система маркеров для прогноза лимфогенного метастазирования / А.М. Бурдённый и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2021. – Т. 172. № 7. – С. 81-86.
17. Логинов В.И. Диагностическое значение группы генов микроРНК, гиперметилированных при немелкоклеточном раке легкого / C.В. Рыков и др. // Патогенез. – 2018. – T. 16. № 3. – C. 112-115.
18. Логинов В.И. Идентификация новых генов микроРНК, гиперметилированных при раке молочной железы / А.М. Бурденный и др. // Молекулярная биология. – 2016. – Т. 50. № 5. – С. 797-802.
19. Логинов В.И. Роль метилирования генов микроРНК в патогенезе первичных опухолей почки и легкого / С. В. Рыков, и др.// Патогенез. – 2015. – Т. 3. – С. 31-40.
20. Логинов В.И., Метилирование генов микроРНК и онкогенез / С.В. Рыков, М.В. Фридман, Э.А. Брага // Биохимия. – 2015. Т. 80 № 2. – С. 184-203.
21. Мисюрина А.Е. Роль экспрессии генов c-MYC, BCL2 и BCL6 в патогенезе диффузной В-крупноклеточной лимфомы // В.А. Мисюрин и др. //Клиническая онкогематология, - 2014. –Т. 7. №4. – С. 512–552.
22. Плосконос М.В., Николаев А.А. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, у больных раком предстательной железы / Проблемы репродукции. - 2013. – Т.6. – С. 14‑17.
23. Пронина И.В. Изменение
В ответ на эти сигналы часть популяции опухолевых клеток будет увеличивать свою подвижность и, в конечном итоге, метастазировать. До настоящего времени остается невыясненным важный аспект: связь между МСК и раковыми клетками происходит до или в результате активации стромы опухоли, или оба процесса активируются одновременно и независимо в результате гипоксии. Тем не менее, начальный этап метастазирования под влиянием этих соединений включает изменение эпителиального фенотипа раковых клеток на мезенхимальный. Данное событие носит название – эпителиально-мезенхимальный переход (ЭMП) (Ishikawa, M. et al., 2014; Asif P.J. et al., 2021).
Далее развитие опухоли обусловлено каскадом различных процессов, приводящих как к молекулярным, так и физиологическим изменениям. Например, замечено влияние МСК на лизилоксидазу (LOX). Тканеспецифичность гена LOX обусловливает его двойственную функцию и при увеличении его экспрессии способствует развитию и прогрессии различных видов онкологии, в частности НМРЛ (Murdocca M. et al., 2021).
Важно отметить, что данный ген находится в тесном взаимодействии с каскадом CD44-TWIST. Этот каскад затрагивает многие гены и процессы, изменения в которых, в конечном итоге, приводят к дифференцировке клеток и усилению метастатического потенциала (Menju T., Date H. 2021). В результ