Оценка модели полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа с использованием олигонуклеотидного гидрогелевого биочипа
Введение
Актуальность работы
Важную роль в патогенезе болезни Альцгеймера (БА) играют генетические факторы. Известным, но не исчерпывающим фактором риска является аллель ε4 гена аполипопротеина Е (APOE), который увеличивает риск развития заболевания в несколько раз. Помимо данного аллеля так же определенный вклад в риск развития БА вносят однонуклеотидные полиморфизмы (SNP, single nucleotide polymorphism), выявленные в ходе масштабных полногеномных ассоциативных исследований (GWAS, genome-wide association studies). Однонуклеотидные полиморфизмы, которые были ассоциированы с БА, за счет небольшой величины эффекта, не показали воспроизводимости результатов, и возможность их использования в качестве самостоятельных факторов риска ограничена.
Для прогнозирования риска развития БА и деменций альцгеймеровского типа перспективным подходом является оценка полигенного риска (ПГР) развития БА, при которой учитывают мультипликативное влияние многих генетических маркеров.
Содержание
Список сокращений и условных обозначений…………………………………4
Введение………………………………………………………………………….5
1 Обзор литературы……………………………………………………………..7
1.1 Болезнь Альцгеймера…………………………………………………………7
1.1.1 Эпидемиология……………………………………………………………9
1.1.2 Этиология и патогенез……………………………………………….……9
1.1.3 Клиническая картина……………………………………………………...10
1.1.4 Диагностика………………………………………………………………..12
1.2 Генетические факторы предрасположенности к развитию болезни Альцгеймера……………………………………………………………………...13
1.2.1 Ген аполипопротеина Е (АРОЕ)………………..…………………………14
1.2.2 Однонуклеотидные полиморфизмы…………………………………....16
1.3 Модели полигенного риска……………………………………………........17
1.4 Методы анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека….21
1.5 Гидрогелевые биологические микрочипы…………………………….…25
2 Материалы и методы……………………..………………………….………..28
2.1 Клинический материал………………………………………………….....28
2.2 Выделение геномной ДНК…………………………………………..……...28
2.3 Измерение концентрации образцов ДНК...………………………………...29
2.4 Подбор праймеров…………………………………………………………...29
2.5 Анализ генетических полиморфизмов на биологических микрочипах….30
2.5.1 Проведение мультиплексной ПЦР……………………………….….…...31
2.5.2 Гибридизация на биологических микрочипах…………………………...33
2.5.3 Отмывка биочипов……….………………………………………..……....33
2.5.4 Регистрация результатов гибридизации………………………………...33
2.6 Метод секвенирования по Сэнгеру………………………………….…….34
2.7 Метод кривых плавления высокого разрешения……………………….….34
2.8 ПЦР с детекцией в режиме реального времени с TaqMan зондами….….36
2.9 Расчет значений полигенного риска……………………………………….37
2.10 Статистический анализ результатов…………………………….…..…...37
3 Результаты и обсуждение…………………………….…………………….39
3.1. Формирование коллекции образцов ДНК……………………………..….39
3.2 Разработка олигонуклеотидного биочипа………………………………….39
3.2.1 Подбор условий гибридизации амплифицированных флуоресцентно-меченных фрагментов геномных локусов на гидрогелевом биочипе……….40
3.2.2 Выбор оптимальных пар дискриминирующих олигонуклеотидных зондов для определения генотипов анализируемых маркеров………..…….41
3.2.3 Подбор праймеров………………………………………………..………46
3.2.4 Оптимизация условий мультиплексной ПЦР…………………….….…50
3.2.4.1 Подбор комбинаций праймеров………………………...……………....50
3.2.4.2. Выбор Taq ДНК-полимеразы………………………………….….…....51
3.2.4.3 Подбор температурно-временного режима ПЦР……………………...53
3.3 Апробация метода с использованием образцов геномной ДНК…….….54
3.4 Верификация результатов генотипирования………………………..…....57
3.5 Анализ полигенного риска в группах пациентов с деменцией альцгеймеровского типа и здоровых доноров…………………………………59
Выводы…………………………………………………………………………...63
Заключение………………………………………………………………………65
Список публикаций по результатам работы…………………………………...67
Список литературы………………………………………………………………69
Список литературы
1.Korologou-Linden R. et al. Polygenic risk scores for Alzheimer’s disease, and academic achievement, cognitive and behavioural measures in children from the general population // Int. J. Epidemiol. 2019. Vol. 48, № 6. P. 1972–1980.
2.Zhou X. et al. Polygenic Score Models for Alzheimer’s Disease: From Research to Clinical Applications // Front. Neurosci. 2021. Vol. 15. P. 650220.
3.Gryadunov D.A. et al. The EIMB hydrogel microarray technology: Thirty years later // Acta Naturae. 2018. Vol. 10, № 4.
4.Al Shehri W. Alzheimer’s disease diagnosis and classification using deep learning techniques // PeerJ Comput. Sci. 2022. Vol. 8. P. e1177.
5.Ungar L., Altmann A., Greicius M.D. Apolipoprotein E, gender, and Alzheimer’s disease: an overlooked, but potent and promising interaction // Brain Imaging Behav. 2014. Vol. 8, № 2. P. 262–273.
6.Cacace R., Sleegers K., Van Broeckhoven C. Molecular genetics of early‐onset Alzheimer’s disease revisited // Alzheimers Dement. 2016. Vol. 12, № 6. P. 733–748.
7.Sims R., Hill M., Williams J. The multiplex model of the genetics of Alzheimer’s disease // Nat. Neurosci. 2020. Vol. 23, № 3. P. 311–322.
8.Международная классификация болезней МКБ-10. Электронная версия.
9.Dubois B. et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria // Lancet Neurol. 2014. Vol. 13, № 6. P. 614–629.
10.Albert M.S. et al. The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer’s disease: Recommendations from the National Institute on Aging‐Alzheimer’s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’s disease // Alzheimers Dement. 2011. Vol. 7, № 3. P. 270–279.
11.Knopman D.S. et al. The National Institute on Aging and the Alzheimer’s Association Research Framework for Alzheimer’s disease: Perspectives from the Research Roundtable // Alzheimers Dement. 2018. Vol. 14, № 4. P. 563–575.
12.Lyketsos C.G. Mental and Behavioral Disturbances in Dementia: Findings Fr
В его основе лежит способность специальных ферментов – рестриктаз специфически расщеплять ДНК в сайтах со строго определенной последовательностью, даже единичная замена в сайте рестрикции препятствует распознаванию данного участка ферментом. ПЦР-ПДРФ позволяет быстро обнаруживать точечные мутации после амплификации геномных последовательностей с помощью ПЦР [64].
Высокоселективная рестриктаза подбирается таким образом, чтобы последовательность ее сайта рестрикции соответствовала участку с исследуемой нуклеотидной заменой. После амплификации анализируемого участка полученный продукт обрабатывают рестриктазой. Далее анализ продуктов рестрикции проводится методом электрофореза и оценивается длина полученных фрагментов, на основании чего делается вывод о наличии нуклеотидной замены и генотипе образца.