Изучение распределения катепсина l во внутриклеточных компартментах нормальных и опухолевых клеток почки человека
Введение
Онкологические заболевания – это большая группа патологий, способная поражать практически любые органы и системы. Опухолевые клетки способны к бесконтрольному росту, выходу за естественные границы и проникновению в другие ткани и органы. Последний процесс называется метастазирование и является лидирующей причиной смертности при онкологии.
На сегодняшний день непрерывно изучаются причины онкологических заболеваний, способы озлокачествления клеток, механизмы развития, инвазии и метастазирования опухолей. Ведется поиск биомаркеров для более ранней и специфичной диагностики онкологий и новых терапевтических мишеней для разработки более эффективных и безопасных методов лечения и снижения смертности и инвалидизации.
Часть этих поисков привела к изучению протеиназ. Протеиназы – ферменты разрушающие связи между аминокислотами в белках – играют роль во множестве процессов связанных с развитием опухолей.
Оглавление
Введение 6
Цель работы 7
Задачи 7
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1 Текущего состояние проблемы и основные признаки онкологических заболеваний 9
1.2 Роль протеиназ в развитии онкологических заболеваний 10
1.2.1 Ремоделирование внеклеточного матрикса 10
1.2.2 Участие протеиназ в эпителиально-мезенхимальном переходе (ЭМП) 11
1.2.3 Ингибиторование протеиназ как терапия онкологических заболеваний 12
1.3 Классификация, структура и функции протеиназ 13
1.3.1 Классификация и общая характеристика протеиназ 13
1.3.2 Механизмы регуляции активности протеиназ 14
1.3.3 Другие функции пропептидов 15
1.4 Классификация, характеристика активности и локализации катепсинов 16
1.5 Характеристика и функции цистеиновых катепсинов 18
1.5.1 Общая характеристика цистеиновых катепсинов 18
1.5.2 Регуляция активности цистеиновых катепсинов 20
1.5.3 Роль цистеиновых катепсинов в норме и при патологии в зависимости от локализации 21
1.5.4 Цистеиновые катепсины как маркер заболеваний 22
1.6 Роль катепсина L (CTSL) в онкологических заболеваниях 23
1.6.1. Участие CTSL в опухолевом ангиогенезе 23
1.6.2 Участие CTSL в инвазии и метастазировании опухолей 24
1.6.3 Роль CTSL в пролиферации клеток 25
1.6.4 Вклад CTSL в избегание апоптоза опухолевыми клетками 25
1.6.4.1 Механизм развития апоптоза 25
1.6.4.2 Участие лизосомального CTSL в развитии апоптоза 27
1.6.4.3 Участие ядерного CTSL в развитии апоптоза 28
1.6.5 Механизмы доставки CTSL в ядро и его функции в ядерной локализации 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 33
2.1. Методы 33
2.1.1 Иммуноблоттинг (вестерн-блот) 33
2.1.2 Работа с эукариотическими клетками 34
2.1.2.1 Используемые клеточные линии 34
2.1.2.2 Получение лизатов эукариотических клеток 34
2.1.2.3 Получение цитоплазматической и ядерной фракций эукариотических клеток 35
2.1.2.4 Трансфекция эукариотических клеток 36
2.1.2.5 Иммунофлуоресцентный анализ 36
2.1.3 Создание плазмидных конструкций 37
2.1.3.1 Полимеразная цепная реакция 37
2.1.3.2 Электрофорез ДНК 38
2.1.3.3 Выделение и очистка ДНК из агарозного геля 38
2.1.3.4 Рестрикция и лигирование в вектор 39
2.1.4. Работа с E. Coli 39
2.1.4.1 Трансформация компетентных клеток E. Coli 39
2.1.4.2 Выделение плазмидной ДНК 40
2.2 Материалы 41
2.2.1 Растворы и антитела, используемые для иммуноблоттинга 41
2.2.2 Растворы для лизирования и фракционирования эукариотических клеток 43
2.2.3 Растворы для приготовления образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии 44
ГЛАВА 3. Результаты 46
3.1. Определение оптимальной концентрации антител для детекции рекомбинантного CTSL 46
3.2. Антитела к катепсину L эффективны для определения внутриклеточного белка 47
3.3. Экспрессия и формы катепсина L в клеточных лизатах эмбриональных и раковых клеток почки человека различны 48
3.4 Катепсин L детектируется в клетках HEK293, 769-Р и A-498 с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии 50
3.5 Формы катепсина L в ядерной локализации различны для эмбриональных и опухолевых клеток почки 52
3.6 Моделирование ядерной локализации CTSL в клеточных линиях почки 53
3.7 Оверэкспрессия катепсина L и экспрессия CTSL-NLS в клетках HEK293T изменяла количество белка в клеточных лизатах 55
3.8 Оверэкспрессия катепсина L и экспрессия CTSL-NLS в клетках HEK293T не приводили к увеличению количества фермента в ядерной локализации 56
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 58
Заключение 61
Выводы 63
Список использованных источников 64
Список использованных источников
1.Bray F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA Cancer J Clin. Wiley, 2018. Vol. 68, № 6. P. 394–424.
2.Hanahan D., Weinberg R.A. The Hallmarks of Cancer // Cell. 2000. Vol. 100. 57–70 p.
3.Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions // Cancer Discovery. American Association for Cancer Research Inc., 2022. Vol. 12, № 1. P. 31–46.
4.Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: The next generation // Cell. 2011. Vol. 144, № 5. P. 646–674.
5.Niland S., Riscanevo A.X., Eble J.A. Matrix metalloproteinases shape the tumor microenvironment in cancer progression // International Journal of Molecular Sciences. MDPI, 2022. Vol. 23, № 1.
6.Cox T.R. The matrix in cancer // Nature Reviews Cancer. Nature Research, 2021. Vol. 21, № 4. P. 217–238.
7.Tagirasa R., Yoo E. Role of Serine Proteases at the Tumor-Stroma Interface // Frontiers in Immunology. Frontiers Media S.A., 2022. Vol. 13.
8.Bassiouni W., Ali M.A.M., Schulz R. Multifunctional intracellular matrix metalloproteinases: implications in disease // FEBS Journal. John Wiley and Sons Inc, 2021. Vol. 288, № 24. P. 7162–7182.
9.Mitschke J., Burk U.C., Reinheckel T. The role of proteases in epithelial -to-mesenchymal cell transitions in cancer // Cancer and Metastasis Reviews. Springer, 2019. Vol. 38, № 3. P. 431–444.
10.Weidow O., Meyer-Hoffert U. Neutrophil serine proteases: potential key regulators of cell signalling during inflammation // Journal of Internal Medicine. 2005. P. 319–328.
11.Hu W. et al. Bortezomib prevents the expression of MMP-13 and the degradation of collagen type 2 in human chondrocytes // Biochem Biophys Res Commun. Academic Press Inc., 2014. Vol. 452, № 3. P. 526–530.
12.Sledge G.W. et al. Effect of Matrix Metalloproteinase Inhibitor Batimastat on Breast Cancer Regrowth and Metastasis in Athymic Mice. 1995.
13.K. E. Porter et al. Marim
1.6.1. Участие CTSL в опухолевом ангиогенезеАнгиогенез – это процесс формирования новых сосудов, он необходим для увеличения размеров опухоли после того, как она достигает 1-2 мм в диаметре. Данные о роли CTSL в этом процессе противоречивы. CTSL, обладая широкой субстратной специфичностью, может расщеплять многие молекулы участвующие в ангиогенезе или их предшественников. Например, коллаген до эндостатина, который ингибирует ангиогенез, и в то же самое время сам эндостатин. Часть статей связывают увеличенную экспрессию катепсина L с повышенной инвазивностью опухолей, например, рака желудка [45–47] и указывают на снижение инвазивности при использовании ингибиторов CTSL. Было показано, что CTSL в ядерной локализации приводит к повышенному расщеплению транскрипционного фактора CDP/Cux. Это способствует транскрипции гликопротеина VEGF -D, который способствует лимфо и ангиогенезу при раке желудка.