Разработка in vitro теста для оценки потенциальной аллергенности клещей, используемых в производстве органической сельскохозяйственной продукции
ВВЕДЕНИЕ
Аллергия является одним из самых распространённых заболеваний в мире. Некоторые специалисты окрестили её болезнью XXI века. Согласно данным ВОЗ, от аллергических заболеваний (АЗ) страдает от 20 до 40% населения Земли, то есть как минимум каждый пятый человек. Помимо вреда здоровью, аллергия также несёт косвенные экономические издержки. Всё это обуславливает большой интерес исследователей по всему миру и побуждает их к созданию новых методов диагностики и лечения АЗ, а также поиску потенциальных аллергенов [1].
В настоящее время большинство разработанных методик нацелены на диагностику уже имеющейся чувствительности к перечню известных аллергенов. Вместе с тем, малочисленные тесты для оценки аллергенности веществ позволяют предотвратить множественные случаи АЗ прежде неустановленного происхождения. Эти тесты оценивают способность агентов вызвать сенсибилизацию – развитие организмом повышенной иммунной чувствительности к аллергену. Сенсибилизация является первой стадией развития аллергической реакции. Она заключается в накоплении специфических антител к антигену и иммунных клеток памяти, которые содержат информацию об этом антигене. Понимание механизмов сенсибилизации позволило создать тесты,
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Аллергия и аллергические реакции 8
1.2 Сенсибилизация 11
1.2.1 Обнаружение антигена и его процессинг 11
1.2.2 Презентация антигена лимфоцитам 13
1.2.3 Переключение B-лимфоцитов на синтез аллерген-специфических IgE 16
1.3 Диагностика сенсибилизации in vitro. Методика h-CLAT 16
1.4 Клещевая сенсибилизация 18
1.4.1 Аллергенные клещи домашней пыли 18
1.4.2 Диагностика аллергии к клещам домашней пыли 20
1.5 Клещи-прокормители в производстве органической сельскохозяйственной продукции 22
1.5.1 Роль клещей-прокормителей в производстве органической сельскохозяйственной продукции 22
1.5.2 Сенсибилизирующие свойства клещей-прокормителей 23
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
2.1 Апробация методики h-CLAT 25
2.1.1 Культивирование клеток 25
2.1.2 Определение дозы воздействия 25
2.1.3 Воздействие контрольных веществ 27
2.1.4 Приготовление препаратов для цитофлуориметрии 28
2.1.5 Анализ экспрессии CD54, CD86 28
2.2 Получение и наработка биомассы клещей 29
2.3 Получение экстрактов клещей Tyrophagus putrescentiae и Thyreophagus entomophagus 30
2.4 Определение концентрации белка в экстракте 31
2.5 Определение рабочей концентрации экстракта клещей 31
2.6 Тестирование экстрактов 32
2.6.1 Воздействие экстрактов 33
2.6.2 Исследование экспрессии CD54/CD86 33
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 34
3.1 Апробация метода h-CLAT на контрольных веществах 34
3.2 Получение экстрактов клещей 40
3.3 Определение рабочей концентрации экстрактов клещей 43
3.4 Исследование экспрессии CD54 и CD86 45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 52
Список литературы 55
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.Rutkowski R., Kosztyła-Hojna B., Rutkowska J. [Allergic rhinitis--an epidemiological, economical and social problem of the XXI century] // Pneumonol Alergol Pol. 2008. Vol. 76, № 5. P. 348–352.
2.Емельянов А.В. Аллергический ринит. Клинические рекомендации. А. С. Лопатина и В. В. Шиленковой. / ed. Лопатин А.С., Шиленкова В.В. Москва: Профмедпресс, 2022. 66 p.
3.Kay A.B. Overview of “Allergy and allergic diseases: with a view to the future” // British Medical Bulletin. 2000. Vol. 56, № 4. P. 843–864.
4.Igea J.M. The history of the idea of allergy // Allergy. 2013. Vol. 68, № 8. P. 966–973.
5.Dribin T.E., Motosue M.S., Campbell R.L. Overview of Allergy and Anaphylaxis // Emergency Medicine Clinics of North America. 2022. Vol. 40, № 1. P. 1–17.
6.Immunobiology: the immune system in health and disease. 6th ed / ed. Janeway C. New York: Garland Science, 2005. 823 p.
7.Poncet P., Sénéchal H., Charpin D. Update on pollen-food allergy syndrome // Expert Review of Clinical Immunology. 2020. Vol. 16, № 6. P. 561–578.
8.Seth D. et al. Food Allergy: A Review // Pediatr Ann. 2020. Vol. 49, № 1.
9.Krčmová I., Novosad J. Anaphylactic symptoms and anaphylactic shock // Vnitr Lek. 2019. Vol. 65, № 2. P. 149–156.
10.Stanwell-Smith R, Bloomfield SF, Rook GA. The hygiene hypothesis and its implications for home hygiene, lifestyle and public health. International Scientific Forum on Home Hygiene.
11.Okada H. et al. The ‘hygiene hypothesis’ for autoimmune and allergic diseases: an update // Clinical and Experimental Immunology. 2010. Vol. 160, № 1. P. 1–9.
12.Stiemsma L.T. et al. The hygiene hypothesis: current perspectives and future therapies // Immunotargets Ther. 2015. Vol. 4. P. 143–157.
13.Liu A.H. Revisiting the hygiene hypothesis for allergy and asthma // Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2015. Vol. 136, № 4. P. 860–865.
Тест h-CLAT основан на анализе изменения экспрессии маркеров CD54 и CD86 на поверхности АПК при воздействии на них целевого сенсибилизирующего агента (рисунок 2). Первоначально предполагалось использование в этих целях клеток Лангерганса, выделенных из кожи доноров, однако их отделение от других клеток представляет собой сложный и трудоёмкий процесс. Впоследствии они были заменены дендритными клетками, получаемыми из моноцитов периферической крови человека. Тем не менее, культивирование ДК таким способом занимало несколько дней и лишь незначительно упрощало методику [31]. Наконец, в качестве альтернативы была предложена и адаптирована иммортализованная (способная «бесконечно» размножаться в культуре) клеточная линия острого моноцитарного лейкоза человека THP-1. Эти клетки отличаются простотой поддержания их жизнедеятельности в культуре и стабильной экспрессией целевых маркеров, что делает возможным их длительное использование в лабораторных условиях [32]. Уровни экспрессии CD54 и CD86 до и после воздействия потенциального аллергена регистрируют с помощью проточной цитофлуориметрии после обработки клето