Определение гидропероксидов фосфолипидов методом хемилюминометрии
ВВЕДЕНИЕ
Одной из актуальных задач современной медицины является оценка воздействия свободнорадикальных процессов (окислительного стресса) на липиды в организме человека. В последние десятилетия окислительный стресс стали ассоциировать с различными заболеваниями: атеросклерозом, болезнями Альцгеймера и Паркинсона, диабетом и даже раком [1].Разрушающему действию свободнорадикальных процессов перекисного окисления подвержены жизненно важные макромолекулы — белки, нуклеиновые кислоты и липиды. В результате протекания этих процессов в биологических системах происходит образование и накопление метаболитов–биомаркеров окислительного стресса. Гидропероксиды липидов — промежуточные метаболиты перекисного окисления в крови человека [2] — одни из ключевых биомаркеров окислительного стресса. Другая мишень свободных радикалов — это фосфолипиды. Определение этих биомаркеров не только позволяет оценить глубину свободнорадикальных нарушений липидного звена, но и имеет важное прогностическое значение. Кроме того, если пероксидация липидов изучена сравнительно подробно, то перекисное окисление фосфолипидов требует систематического рассмотрения механизмов и поиска его высокоэффективных ингибиторов (антиоксидантов).Решение задач как определения гидропероксидов фосфолипидов, так и исследования механизмов пероксидации требует разработки методов и подходов, которые должны обеспечивать специфичность, точность, высокую чувствительность, доступность, надежность (достоверность), а также возможность определения в сложных системах (in vivo, в мутных средах и т. д.).
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Перекисное окисление липидов и фосфолипидов
2. Методы оценки перекисного окисления липидов и фосфолипидов
3. Хемилюминесценция для изучения перекисного окисления фосфолипидов
4. Постановка задачи
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Реагенты и аппаратура
2. Хемилюминесцентное определение гидропероксидов фосфолипидов в системе с гемоглобином
3. Определение гидропероксидов фосфолипидов в культурах клеток
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Варьирование концентраций гемоглобина
2. Варьирование концентраций субстрата
3. Варьирование концентрации активатора
4. Выводы по разделам 4.1-4.3
5. Влияние УФ-облучения как модели окислительного стресса на гидропероксиды фосфолипидов
6. Определение гидропероксидов фосфолипидов в реальных объектах
7. Определение антиоксидантов в системе Hb/гидропероксид фосфатидилхолина/кумарин 334
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ADDIN EN.REFLIST 1.Niki E. Lipid peroxidation: physiological levels and dual biological effects // Free Radical Biology and Medicine. 2009. V. 47. № 5. P. 469-484.
2.Walter M.F., Jacob R.F., Bjork R.E., Jeffers B., Buch J., Mizuno Y., Mason R.P., Investigators P. Circulating lipid hydroperoxides predict cardiovascular events in patients with stable coronary artery disease: the PREVENT study // Journal of the American College of Cardiology. 2008. V. 51. № 12. P. 1196-1202.
3.Владимиров Ю.А., Проскурина, Е. В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. 2009. V. 49. № 7. P. 341-388.
4.Niki E. Lipid peroxidation products as oxidative stress biomarkers // Biofactors. 2008. V. 34. № 2. P. 171-180.
5.Kattoor Aj P.N., Palagiri D, Mehta Jl Oxidative Stress in Atherosclerosis // Curr Atheroscler Rep. 2017. V. 19. № 11. P. 42.
6.Fuchs B., Bresler K., Schiller J. Oxidative changes of lipids monitored by MALDI MS // Chemistry and Physics of Lipids. 2011. V. 164. № 8. P. 782-795.
7.Catalá A. An overview of lipid peroxidation with emphasis in outer segments of photoreceptors and the chemiluminescence assay // The international journal of biochemistry & cell biology. 2006. V. 38. № 9. P. 1482-1495.
8.Reis A. S.C.M. Chemistry of phospholipid oxidation // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V. 1818. . № 10. P. 2374-2387.
9.Rolewski P., Siger A., Nogala-Kałucka M., Polewski K. Chemiluminescent assay of lipid hydroperoxides quantification in emulsions of fatty acids and oils // Food research international. 2009. V. 42. № 1. P. 165-170.
10.Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Носков А.И. Гемоглобины человека // Вестник Астраханского государственного технического университета. 2007. № 6. P. 34-41.
11.https://www.researchgate.net/figure/Structure-of-Hemoglobin-Protein-Hemoglobingentr-https-hemoglobingentr-Access_fig22_349573893 // Structure of hemoglobin [электронный ресурс].
Существующие методы количественного анализа фосфолипидных гидропероксидов либо неспецифичны и малочувствительны, либо требуют использования хроматографического оборудования с соответствующим программным обеспечением, коммерчески недоступным широкому кругу клиник и лабораторий.Хемилюминесцентная спектрометрия для системы гемоглобин/кумарин 334 характеризуется специфичностью, высокой чувствительностью, экспрессностью, что делает возможным применение ее как доступный лабораторный тест в клинической практике. ЯкорьС помощью этого метода можно определять гидропероксиды фосфолипидов, участвующие в перекисном окислении фосфолипидов.Целью настоящей работы является разработка методики определения гидропероксидов фосфолипидов методом хемилюминометрии.В качестве компонентов исследуемой аналитической системы выбраны модельные системы, включающие индуктор дезоксигемоглобин, субстраты — гидропероксиды линолевой кислоты, фосфатидилхолина, кардиолипина и фосфатидилсерина, — и активаторы хемилюминесценции кумарин 334 и кумарин 314. Для достижения поставленной цели требуется решить следующие задачи:Изучить роль дезоксигемоглобина как индуктора процессов перекисного окисления фосфолипидов в системах с различными субстратами и определить рабочие условия,Исследовать систему при варьировании субстрата — окисляемого фосфолипида — в системе с дезоксигемоглобином и определить диапазон определения,Применить разработанную методику для анализа реальных объектов — культуры клеток после различных доз УФ-облучения,Исследовать возможность применения методики в обратном варианте для определения антиоксидантов ресвератрола и кверцетина.